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基因定量分析技术

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  基因定量分析技术的应用价值
  近年来基因定量分析的价值受到越来越多研究者的重视。过去由于过分强调了感染后过强的细胞免疫应答介导肝细胞损伤,忽视了对病毒复制水平与致病性之间因果关系的研究。目前普遍认为,尽管不直接破坏寄生细胞,但病毒的活跃复制是启动或激发肝脏组织炎症反应的因素。这表明确定感染者体内复制状态,即从基因定量的角度作病情分析是十分有意义的。事实上,真正引起人们关注基因定量分析价值的重要原因是最近发现了干扰素治疗与基因水平两者之间有非常密切的关系。基因定量分析还在转基因动物、基因治疗、蛋白疫苗和核酸疫苗、抗药物体外试验和动物试验及耐药研究、流行病学研究、血液制品污染监测等方面具有重要的应用价值。
  一、基因定量分析在干扰素治疗中的应用
  尚无药物可以清除所有感染者体内颗粒。干扰素是目前唯一有一定疗效的一类生物制剂它在病毒等诱导下由几种相关细胞产生,并发挥抗病毒作用。但是无论使用何种干扰素,也无论治疗剂量或疗程如何,干扰素治疗后转阴率迄今仍保持在左右,无法进一步提高,究竟有哪些制约因素起作用尚无定论。
  近年来发现干扰素的治疗效果,即干扰素治疗后的反应性很大程度上取决于在体内的复制水平。以下几点事实值得注意⑴治疗前低水平复制者的反应性明显优于高水平复制者。转阴的几乎都是那些治疗前血清含量较低者,而治疗前含量特别高者大多没有疗效;⑵治疗中病毒复制水平迅速降低者,有望治愈。相反,治疗期间基因水平下降较慢,或下降幅度较小,或变化不明显者,大多是无效者;⑶治疗结束后,采用定量法检测,完全转阴者可能不再复发,而终止治疗后仍保持较低水平者,反跳的可能性较大。可见,使用干扰素治疗感染时,在各种近期和远期疗效指标中,除了病人的临床表现是否好转,生化指标是否改善,肝组织炎症反应是否减轻等以外,血清定量分析是一个十分重要的观察项目。从现有研究资料看,除病理检查外,定量检测,也许是干扰素治疗效果判断依据中最直接、最可靠和最有价值的指标。多数研究者认为,通过定量分析来指导干扰素治疗,有重大意义。首先,在治疗对象的选择方面,即确定干扰素治疗适应症时,应对各侯选病例在某个时间段内定期反复检测水平,那些长期保持高复制水平者不宜接受干扰并素治疗,或应当联合治疗;其次,干扰素治疗期间,可根据基因水平的动态变化适时调整治疗剂量,决定是否缩短或延长疗程,及是否终止治疗。这不仅对制订合理的治疗方案,也对减轻病人负担,避免不恰当用药有指导意义。笔者认为,目前国际上普遍采用的所谓“六个月疗程”及某些中高剂量治疗方案均缺乏充分和足够的立论依据,有必要结合基因定量分析结果,重新评价和制订干扰素治疗计划;最后,干扰素治疗结束后,对有反应者定期作定量分析,有助于发现复发者,并根据血清含量波动情况决定是否实施再治疗。有人报告,首次干扰素治疗有效者,再治疗的效果亦佳。如果第一次治疗无反应或反应较差者,第二次干扰素治疗仍不能取得理想疗效。
  二、基因定量分析的其他临床价值
  感染后,在临床表现方面的差异非常明显可以表现为无症状携带者、急性肝炎、慢性肝炎、暴发型肝炎、肝硬化及肝癌等多种疾病状态。病毒在肝细胞内的复制水平与各种临床疾病状态之间可能存在着某些必然联系。由于基因定量技术的发展和成熟,目前已有可能从某些现象上阐明复制与致病性之间的“量效”关系。
  ㈠“无症状携带者”可能为活动性乙肝患者。有部分感染者,由于免疫耐受或其它原因,体内呈复制不活跃的“潜伏”状态,但并不意味着不存在进行性肝损害。等研究发现无症状携带者在其自然发展史上,复制处于波动状态,时有加剧,病毒复制积累到一定程度后水平增加。一般规律是血清水平上升活性增加抗滴度提高。因此无症状携带者应采取积极治疗措施,否则这类人群不仅作为重要的病毒库传播,而且由于隐匿性肝细胞损伤的不断积累,不经过慢性肝炎阶段,直接向肝硬化和肝癌发展。
  ㈡水平与感染者病情和预后的关系密切。上述无症状携带者是一个特殊群体。而对那些急性和慢性乙型肝炎患者而言,水平对预后判断有帮助。研究发现一直保持较高水平的急性肝炎患者易慢性化,而复制水平较高的慢性肝炎患者不仅对干扰素治疗的反应性差,而且肝组织炎症反应更明显,病情更重,更易发生肝硬化和肝癌。目前在能否用血清水平来判断肝组织炎症损伤程度这类问题上尚有争议。动物实验表明,鸭肝被广泛感染的同时,并不伴随明显病毒血症肝细胞清除病毒的同时也无病毒血症加重的证据。然而最近有人对感染者进行基因定量分析研究,发现水平与水平以及肝脏分级之间有密切关系。
  ㈢肝移植者定量的意义
  等报告肝移植前患者血清水平的高低决定移植后肝脏是否再感染。作者观察到,例移植前血清含量低于拷贝,移植后不间断地采用免疫预防,随访个月,无一例再发肝炎,但另外两例移植前病毒拷贝数大于则发生了严重再感染。建议移植前使用抗药物,最大限度降低血清浓度,有助于防止侵犯移植后肝脏,提高肝脏移植的效果。
  ㈣前核基因突变定量意义
  前核基因突变可导致表达缺失。感染不表达的突变株,或野生型在体内突变并成为优势株均产生较严重的后果,如易发生暴发性肝炎,预后差,干扰素治疗无效等。目前已能采用核酸序列测定技术、技术、限制性片段长度多态性分析技术等来定性检测前核基因突变。最近建立了一种及产物的显色反应点突变分析技术,用来定量分析突变前核基因,有助于进一步探讨突变与致病性之间的关系。
  基因定量分析是一项临床应用型技术,但对基础研究也有一定的应用价值,尤其是在当前基因治疗、转基因动物、核酸疫苗等热点研究领域,基因定量分析可能是一种很好的辅助手段,对发现一些有意义的现象也许有一定帮助。比如在转基因小鼠组织脏器分布规律可用定量标准来衡量,以及用定量手段观察各种药物、细胞因子和其它物质对转基因小鼠基因复制的调节作用。又如对核酸疫苗注入肌组织后的各种动力学变化的研究远未深入,如能采用定量手段,分析抗原表达基因在体内的存在状态无疑是有益的。至于各种抗药物,无论是在体外细胞模型包括转基因细胞模型还是在动物模型的研究,或在人体研究,采用基因定量分析,应当是考核药物疗效的最佳手段。

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